紐約自然博物館重新開張，小保安賴瑞·戴利（本·斯蒂勒 Ben Stiller 飾）帶領泰迪·羅斯福（羅賓·威廉姆斯 Robin Williams 飾）策劃了精彩的開幕演出。誰知演出剛剛沒多久，泰迪、猴子他們便陷入混亂，所有博物館的夥伴們大鬧會場，賴瑞為此焦頭爛額。事後他發現，復活黃金碑正被綠色的物質腐蝕，而這種情況似乎導致了藏品們的瘋狂。賴瑞查找資料，斷定黃金碑背後隱藏著不為人知的秘密。為了組織混亂情況的蔓延，他決定前往大英博物館求助法老王阿卡曼拉的父親，當然那堆搞怪的藏品也都尾隨而至。途中他們遇見了圓桌騎士蘭斯洛特爵士，還和屋大維等夥伴走散。
久違的奇妙冒險，就在夜幕下的大英博物館的展開……